Biologie Moléculaire- Génétique - Biotechnologies : Caryotype

GÉNÉTIQUE section II, ITEM 6.1

Caryotype

Prérequis

▶ Connaissances sur la structure de l'ADN (acide désoxyribonucléique) et ses différents niveaux de compaction.

▶ Connaissances sur la mitose.

DÉFINITION DU CARYOTYPE

CHROMOSOME MÉTAPHASIQUE ET CARYOTYPE

Le caryotype (figure 6.1.1A) :

▶ c'est la constitution chromosomique d'un individu dans laquelle les chromosomes sont classés en fonction de leur taille et de la position des centromères grâce à une observation des chromosomes au microscope optique; ▶ le premier caryotype a été réalisé en 1956 et la première anomalie chromosomique (trisomie 21) a été observée en 1959.

La cytogénétique étudie les chromosomes d'un individu à l'aide de prélèvements prénataux (liquide amniotique, villosité choriale, sang fœtal) ou postnataux (sang veineux, biopsie cutanée) (voir item 55).

La cytogénétique médicale a pour objectif de détecter les anomalies chromosomiques constitutionnelles ou acquises pour réaliser un diagnostic médical et/ou du conseil génétique.

Le caryotype est réalisé sur des cellules en métaphase ou prométaphase lorsque les chromosomes sont à l'état maximal de condensation et peuvent être observés en microscopie optique. Le chromosome métaphasique (figure 6.1.1B) est constitué de :

▶ 2 chromatides sœurs : chaque chromatide sœur correspond à une molécule d'ADN; ▶ 1 centromère ou constriction primaire : partie très condensée du chromosome qui correspond au point d'association entre les 2 chromatides sœurs avec un rôle clé dans la division cellulaire (site de fixation des microtubules au niveau des kinétochores); ▶ 2 télomères : région constituée de séquences répétées de l'ADN, non codante et située aux extrémités de chaque chromatide sœur. Le centromère ou constriction primaire permet de séparer le chromosome en deux régions :

▶ le bras court, noté p (situé au-dessus du centromère sur les schémas, par convention); ▶ le bras long, noté q (situé en dessous du centromère sur les schémas, par convention). La position du centromère dans les chromosomes permet de distinguer trois types morphologiques de chromosomes (figure 6.1.1B) : ▶ chromosome métacentrique : les bras courts et longs sont de taille équivalente ; index centrométrique proche de 0,5 ; ▶ chromosome submétacentrique : le bras court p est nettement plus petit que le bras long q; index centromérique inférieur à 0,5; ▶ chromosome acrocentrique : le bras court p est quasi inexistant (centromère proche d'une extrémité chromosomique); index centromérique proche de 0. L'index centromérique est le ratio : taille du bras court p/ (taille du bras court p + taille du bras long q).

CLASSEMENT DES CHROMOSOMES DANS LE CARYOTYPE

Le caryotype humain (figure 6.1.1A) est constitué de 23 paires de chromosomes : ▶ 22 paires de chromosomes non sexuels ou autosomes; ▶ 1 paire de chromosomes sexuels ou gonosomes : 2 chromosomes X chez la femme; 1 chromosome X et 1 chromosome Y chez l'homme. Le classement des chromosomes dans un caryotype suivant la classification de Denver s'effectue selon 2 critères : la taille des chromosomes et la position du centromère : 1-classement des 22 paires d'autosomes par taille décroissante; 2-classement des 22 paires d'autosomes par index centromérique décroissant : les chromosomes métacentriques en premier, ensuite les submétacentriques et enfin les acrocentriques. De manière conventionnelle, la paire de gonosomes est placée en dernière position, en bas, à droite. En outre, les chromosomes sont répartis en 7 groupes notés de A à G (figure 6.1.1A) : ▶ groupe A : chromosomes 1 à 3, grands et métacentriques; ▶ groupe B : chromosomes 4 et 5, grands et submétacentriques; ▶ groupe C : chromosomes 6 à 12 et chromosome X, moyens et submétacentriques; ▶ groupe D : chromosomes 13 à 15, moyens et acrocentriques; ▶ groupe E : chromosomes 16 à 18, petits et submétacentriques; ▶ groupes F : chromosomes 19 et 20, petits et métacentriques; ▶ groupe G : chromosomes 21,22 et Y, petits et acrocentriques. La classification de Denver préconise l'observation de 15 mitoses et la réalisation de 3 classements indépendants par patient. Le marquage des différentes bandes des chromosomes (ou «banding») aide à la reconnaissance des paires de chromosomes (voir «Technique de cytogénétique conventionnelle» pour la technique de coloration des bandes). Initialement entièrement manuel, le classement des chromosomes est maintenant informatisé et réalisé à l'aide d'analyseurs d'images. Cependant, les logiciels actuels de classement automatique font beaucoup d'erreurs et le classement reste manuel. La formule chromosomique indique le nombre de chromosomes total, les chromosomes sexuels et les éventuelles anomalies chromosomiques de nombre et/ou de structure : ▶ formule chromosomique pour une femme sans anomalie chromosomique : 46,XX; ▶ formule chromosomique pour un homme sans anomalie chromosomique : 46,XY.

TECHNIQUE DE CYTOGÉNÉTIQUE CONVENTIONNELLE

RÉALISATION D'UN CARYOTYPE

La réalisation d'un caryotype (figure 6.1.2) nécessite un prélèvement de tissus vivants (le plus facile étant le sang) et la mise en culture de ce tissu. Trois étapes principales sont ensuite nécessaires pour préparer un caryotype : ▶ étape 1 : mise en culture et traitement des cellules afin d'obtenir des cellules en mitose : ▪ prélèvement de sang veineux (5 ml) et isolement des lymphocytes, ▪ mise en culture des cellules pendant 48–72 heures en présence de phytohémagglutinine (lectine de plantes), agent mitogène capable de stimuler la prolifération des lymphocytes, ▪ traitement des cellules avec de la colchicine ou du colcémide (poisons du fuseau mitotique qui bloquent la dépolymérisation des microtubules) afin de bloquer les cellules en métaphase; ▶ étape 2 : traitement des cellules afin de permettre la libération des chromosomes métaphasiques : ▪ incubation des cellules dans une solution hypotonique afin d'induire le gonflement des cellules. La rupture de la membrane plasmique et de l'enveloppe nucléaire surviendra lors du dépôt sur la lame, libérant les chromosomes, ▪ fixation par un mélange d'alcool et d'acide acétique; ▶ étape 3 : dépôt et coloration des chromosomes métaphasiques : ▪ dépôt et étalement des chromosomes métaphasiques sur lame, ▪ coloration des chromosomes (technique de «banding») avec apparition d'une succession de bandes caractéristiques de chaque paire de chromosomes, ▪ observation de plusieurs mitoses et classement des chromosomes à l'aide d'analyseurs d'images.

TECHNIQUES DE COLORATION DES BANDES

Les techniques de coloration des bandes ont été développées dans les années 1970 et aident à l'identification et au classement correct de chaque paire de chromosomes. Elles permettent aussi de mettre plus facilement en évidence les anomalies de structure. Trois types de bandes sont classiquement mis en évidence en clinique (tableau 6.1.1) : ▶ bandes G (Giemsa); ▶ bandes R (reverse, inverse); ▶ coloration NOR (Nucleolar Organizing Region). Des techniques de marquage à haute résolution, plus récentes, permettent une coloration des chromosomes lorsqu'ils ne sont pas à leur état maximal de condensation, en prophase ou en prométaphase. Toutefois, ces techniques sont peu utilisées depuis le développement de la CGH Array plus simple à mettre en œuvre (voir item 6.2). Les bandes de chaque paire de chromosomes sont numérotées, du centromère vers le télomère. Cette numérotation des bandes permet de les identifier (figure 6.1.1C) (voir item 6.5). Tableau 6.1.1 Techniques de coloration des bandes

ARN : acide ribonucléique; NOR : Nucleolar Organizing Region.

Pour identifier une bande sur un chromosome, il faut indiquer : 1-le numéro du chromosome; 2-le symbole du bras; 3-le numéro de la région; 4-la bande dans cette région; 5-éventuellement, le numéro de la sous-bande; 6-éventuellement, le numéro de la sous-sous-bande. Dans ce cas, bande et sous-bande sont séparées par 1 point. Exemple : 1p36.12 fait référence à la sous-sous-bande 2 de la sous-bande 1 de la bande 6 de la région 3 du bras court du chromosome 1.

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