Méthodes en immunologie : nouvelle édition

Un ouvrage complet et synthétique sur toutes les méthodes en immunologie

Rédigé par des professionnels de la discipline, cet ouvrage s’adresse aux chercheurs et enseignants-chercheurs ainsi qu’aux étudiants en Master ou en Doctorat. Son lectorat comporte également tous les personnels des laboratoires de recherche académique ou industrielle dans les secteurs concernant la biologie (sciences de la vie, pharmacie, vétérinaire, recherche médicale, bioréactifs, équipement de laboratoires...).

Le plan de l'ouvrage Méthodes en immunologie S’ouvre dans une nouvelle fenêtre est le suivant : Chapitre 1 : L'antigène comme réactif : définition et propriétés; Chapitre 2 Les anticorps comme réactifs et outils thérapeutiques; Chapitre 3 Techniques sans traceur; Chapitre 4 Techniques avec traceurs; Chapitre 5 Techniques de biologie moléculaire; Chapitre 6 Tests cellulaires; Chapitre 7 Modèles et tests in vivo; Chapitre 8 Exploration du complément ; Chapitre 9 Exploration des immunoglobulines; Chapitre 10 Exploration de pathologies impliquant le complément; Chapitre 11 Détection/dosage des cytokines et de leurs récepteurs; Chapitre 12 Exploration du complexe majeur d'histocompatibilité; Chapitre 13 Hypermutations somatiques et translocations chromosomiques; Chapitre 14 Immunohématologie;

Nous vous invitons à découvrir le début du chapitre 4 dont le plan est le suivant : Chapitre 4 Techniques avec traceurs

Types de traceurs

Les enzymes comme traceurs

Les fluorochromes comme traceurs

Les radio-isotopes comme traceurs

Dosages immuno-enzymatiques (ELISA) ou immuno-fluorescents (FLISA)

Des dosages radio-immunologiques (RIA) à la spectrométrie de masse

Dosages radio-immunologiques

Spectrométrie de masse

Immunodosages multiplexes

Immuno-empreinte/western blot

Immunofixation

Puces à protéines (protein arrays)

Cytométrie en flux

Marquages cellulaires et tissulaires, immunocytologie et immunohistologie

Puce tissulaire (tissue microarray)

ELISpot et FLUOROSpot

Techniques avec traceurs

Types de traceurs

Dans la plupart des cas, les immuno-analyses utilisent un réactif (antigène ou anticorps) associé à un traceur détectable permettant de révéler la liaison antigène–anticorps spécifique. Les traceurs augmentent la sensibilité d’une immuno-analyse et permettent de déceler des quantités plus faibles de cible que les méthodes qui ne les utilisent pas. Trois grands types de traceurs sont utilisables, des enzymes , des fluorochromes et des radioisotopes. Initialement, ce sont ces derniers qui ont permis la mise en évidence de réactions antigène–anticorps non décelables directement. Les contraintes liées à l’utilisation des radio-isotopes ont conduit à développer des méthodes immunoenzymatiques et d’immunofluorescence qui ont progressivement supplanté les techniques radioimmunologiques.

Les enzymes comme traceurs

L’utilisation d’enzymes comme traceurs a été introduite dans la seconde moitié du xx^e siècle pour offrir une alternative aux radio-isotopes. Pour être efficaces en tant que traceurs, les enzymes candidates doivent privilégier des contraintes michaeliennes avec un faible K_M pour leur substrat, catalyser des réactions irréversibles, être stables, résistantes aux interférences et faciles à conjuguer sans perte d’activité. L’activité enzymatique en présence d’un substrat adapté et d’un chromogène¹ génère un produit coloré proportionnellement à la quantité d’enzyme et donc de la molécule à laquelle elle est conjuguée. La mesure est réalisée à l’aide d’un spectrophotomètre et le résultat est exprimé en unités arbitraires de densité optique (DO). En métabolisant plusieurs molécules de substrat, les enzymes amplifient le signal, permettant la détection de très faibles quantités de cibles. Le substrat et le chromogène non dégradés ne doivent pas perturber la lecture et le produit coloré doit être facilement détectable. De plus, il est préférable que l’enzyme, le substrat et le produit soient absents des préparations à analyser.

¹ . Un chromogène est une molécule incolore capable de former un produit coloré à la suite d’une réaction chimique. Par exemple, la diaminobenzidine (DAB) est oxydée lorsque la peroxydase catabolise le peroxyde d’hydrogène (H₂O₂).

En raison de leur très grande spécificité, les anticorps sont souvent utilisés dans des réactions immuno-enzymatiques qualitatives ou quantitatives visant à détecter des antigènes. Le couplage du traceur sur les anticorps ne doit pas altérer leur immunoréactivité ni la capacité du traceur à générer un signal.

Dans les techniques immuno-enzymatiques en phase liquide, le produit coloré doit demeurer soluble et rester détectable par spectrophotométrie ou chimioluminescence. Dans les techniques en phase solide ( e.g. membranes synthétiques, cellules, tissus), le produit coloré précipite au site précis de la réaction antigène–anticorps et est détecté macroscopiquement ou microscopiquement.

L’anticorps (ou l’antigène) est couplé à une enzyme soit de façon covalente, soit par des liaisons non covalentes biospécifiques. Pour le couplage covalent, les méthodes les plus courantes utilisent le glutaraldéhyde, le m-periodate ou des dérivés de maléimide. L’utilisation d’esters de Nhydroxysuccinimide (NHS) permet d’établir un pontage entre l’enzyme et l’anticorps. Le système biospécifique de conjugaison non covalente est fondé sur l’interaction entre la biotine (vitamine soluble, appelée selon les pays vitamine B8, B7 ou H) et la streptavidine (purifiée à partir de Streptomyces avidinii ) ou l’avidine (isolée des blancs d’œufs). Cette interaction a une affinité extrêmement forte de l’ordre de 10⁻¹⁴ M. Deux systèmes peuvent être utilisés. Dans le plus simple, la biotine est conjuguée à l’anticorps et la streptavidine à l’enzyme, toutes deux de façon covalente. Une alternative permet de développer un système d’amplification de la réaction antigène–anticorps. En effet, jusqu’à quatre molécules de biotine peuvent se lier à une molécule de streptavidine. L’addition à la réaction finnale de molécules de biotine bivalentes (liées à l’aide d’un agent réticulant ou linker ) couplées à l’enzyme et de streptavidine permet la formation de volumineux complexes dans lesquels les sites restés libres de la streptavidine reconnaissent la biotine de l’anticorps conjugué. C’est le système streptavidine–biotine ou avidine–biotine ( avidin–biotin complex ou ABC) (fig. 4.1).

Fig. 4.1. Représentation schématique du système d’amplification du complexe avidine–biotine (ABC).

Les enzymes les plus utilisées sont la peroxydase et la phosphatase alcaline en raison de leur simplicité d’utilisation et de leur sensibilité (tableau 4.1).

Tableau 4.1. Caractéristiques des différents substrats de la réaction enzymatique développée en immuno-analyse.

La peroxydase de raifort (horseradish peroxidase ou HRP), présente dans des racines de végétaux tels que les radis noirs, est une petite glycoprotéine de 40 kDa, ce qui lui permet de diffuser facilement dans les tissus ou les cellules lors des marquages, tout en limitant les interférences avec la protéine conjuguée. Elle catalyse la réaction d’oxydoréduction suivante qui aboutit à former un chromogène oxydé et de l’eau :

H₂O₂ + [chromogène rèduit incolore] - H₂ -> 2H₂O + [chromogène oxydé coloré]

Elle peut aussi catalyser l’oxydation du luminol en 3-aminophthalate pour les techniques fondées sur la chimioluminescence. La HRP peut aussi dans ce cas être amplifiée par certains produits chimiques ( enhancers ) pour faciliter la détection de la réaction d’où le terme enhanced chemiluminescence (ECL). À côté de cette dernière, d’autres modes de la luminescence existent. De nombreux tests développent l’électrochimioluminescence, la photoluminescence, la thermoluminescence et la radioluminescence. L’électrochimioluminescence repose sur la propriété de métaux, notamment du ruthénium, à générer de la lumière sous l’influence d’un fort champ électrique.

La phosphatase alcaline (PAL), absente des végétaux, est dérivée d’intestins de veau ou d’ Escherichia coli. Elle catalyse l’hydrolyse d’une liaison ester monophosphate pour libérer un ion phosphate et un groupement hydroxyle libre en présence d’eau. Par exemple, le paranitrophényl (pNP) phosphate incolore est ainsi transformé ennparanitrophényle jaune :

[pNP] − HPO^-_{4 +} H₂O  → [pNP] − OH + H₂PO^-₄

Les autres enzymes utilisées incluent l’acétylcholinestérase de l’organe électrique de l’anguille électrique ( Electrophorus electricus ) et, de façon moins courante, la β -galactosidase d’ E. coli. En général, les réactions enzymatiques sont arrêtées par l’addition de solutions d’acide ou de base diluées qui changent le pH du milieu et inactivent l’enzyme.

Vous venez de lire un extrait de l'ouvrage Méthodes en immunologie.

Méthodes en immunologie © 2020 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Auteurs

Ce livre a été rédigé sous l’égide de l’ASSIM, Association des Collèges des Enseignants d’Immunologie. Il a été coordonné par Marie-Christine Béné, PU-PH en hématologie CHU de Nantes et faculté de médecine, université de Nantes ; Christian Drouet , PU-PH en immunologie, université de Paris et Hôpitaux Paris Centre, site Cochin APHP, Paris ; Sylvain Fisson , PU en immunologie, faculté des sciences fondamentales appliquées, université d’Évry Val d’Essonne – Paris Saclay ; Sylvie Fournel, PU en immunologie, faculté des sciences de la vie, université de Strasbourg ; et Estelle Seillès, PU-PH en immunologie, CHU de Besançon et UFR des sciences de la santé, université de Franche-Comté.